问题 |
原因 |
解决方案 |
条带形状不好看
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胶凝的不均匀,聚合不好
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灌胶前将溶液充分混匀
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上样齿扭曲使上样孔大小不一
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上样前用针头将齿拨正,注意不要将针头插入胶内
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某些样品盐浓度较高
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除盐或将样品盐浓度调成一致
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每孔上样量不一致
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调整上样量使基本一致
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缓冲液陈旧,成分改变
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重配
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凝胶下面有气泡
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电泳前先将气泡赶走
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电泳时温度过高
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降低电流或电压
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目的伟德体育在线信号弱
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样品上样量不足或目的伟德体育在线浓度过低
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加大上样量或浓缩样品
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转膜效率低
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以下单列
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抗体浓度低
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增加抗体浓度或延长孵育时间
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显色剂底物浓度不足
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增加显色剂用量
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显色剂失效
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更换显色剂(吸取A、B液的枪头不可混用)
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显色或曝光时间不足
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延长显色或曝光时间
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转膜效率低
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转膜缓冲液pH值与目的伟德体育在线等电点相近
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提高转膜缓冲液pH值
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凝胶与膜之间存在气泡
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转膜前要排尽气泡
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凝胶与转印膜两侧滤纸大面积接触
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滤纸、转印膜和凝胶大小要基本一致,避免滤纸直接接触
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转印膜种类选择不当
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使用质量可靠的PVDF膜或硝酸纤维素膜
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电压或电流过小
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湿转时20mA恒流,半干转时25V左右恒压
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转印时间过长或过短,伟德体育在线还在凝胶中或穿透转印膜
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先电泳,根据伟德体育在线大小及转印装置选择合适的转印时间
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湿转过程中环境温度过高
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使用预冷的转膜缓冲液或将装置至于4度
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显色或曝光后无条带
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胶与膜方向反了
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转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极。
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选用的一抗、二抗及显色方法不合适
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选择合适的一抗、二抗和显色方法
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目的伟德体育在线含量低于检测下限
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加大上样量或浓缩样品
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抗体效价过低
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增加抗体浓度
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抗体孵育时间不足
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延长孵育时间,37°C孵育1小时以上
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抗体过度洗涤
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减少洗涤时间及次数
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加入HRP底物反应与曝光检测之间间隔时间过长
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反应3到5分钟及时检测
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背景过高
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封闭物用量不足
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提高封闭物浓度,孵育时保证封闭液完全浸没转印膜
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封闭物使用不当
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检测生物素标记的伟德体育在线时不可用脱脂奶粉封闭
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封闭时间不够
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室温37度封闭1小时以上,4度封闭过夜
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抗体非特异性结合
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降低抗体浓度,减少孵育时间
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抗体浓度过高或洗涤不够
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降低抗体浓度,增加洗涤次数和时间
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化学显色底物过多
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按说明书加入适量的显色底物
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杂带多
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杂伟德体育在线多
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处理目的伟德体育在线
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抗体特异性不强
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使用特异性强的抗体
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抗体孵育时间过久
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减少抗体孵育时间
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二抗与抗原有交叉反应
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选择合适的封闭物
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底物显色与曝光时间长了
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缩短显色及曝光的时间
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大分子量WB
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膜孔径太小
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更换孔径较大的膜
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转膜电压电流低
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提高电压/电流
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转膜时间短
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延长转膜时间
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胶浓度太大
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使用低浓度的胶
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转膜缓冲液配方不合适
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调整转膜缓冲液中甲醇及SDS浓度
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