| 问题 |
原因 |
解决方案 |
|
条带形状不好看
|
胶凝的不均匀，聚合不好
|
灌胶前将溶液充分混匀
|
|
上样齿扭曲使上样孔大小不一
|
上样前用针头将齿拨正，注意不要将针头插入胶内
|
|
某些样品盐浓度较高
|
除盐或将样品盐浓度调成一致
|
|
每孔上样量不一致
|
调整上样量使基本一致
|
|
缓冲液陈旧，成分改变
|
重配
|
|
凝胶下面有气泡
|
电泳前先将气泡赶走
|
|
电泳时温度过高
|
降低电流或电压
|
|
目的伟德体育在线信号弱
|
样品上样量不足或目的伟德体育在线浓度过低
|
加大上样量或浓缩样品
|
|
转膜效率低
|
以下单列
|
|
抗体浓度低
|
增加抗体浓度或延长孵育时间
|
|
显色剂底物浓度不足
|
增加显色剂用量
|
|
显色剂失效
|
更换显色剂（吸取A、B液的枪头不可混用）
|
|
显色或曝光时间不足
|
延长显色或曝光时间
|
|
转膜效率低
|
转膜缓冲液pH值与目的伟德体育在线等电点相近
|
提高转膜缓冲液pH值
|
|
凝胶与膜之间存在气泡
|
转膜前要排尽气泡
|
|
凝胶与转印膜两侧滤纸大面积接触
|
滤纸、转印膜和凝胶大小要基本一致，避免滤纸直接接触
|
|
转印膜种类选择不当
|
使用质量可靠的PVDF膜或硝酸纤维素膜
|
|
电压或电流过小
|
湿转时20mA恒流，半干转时25V左右恒压
|
|
转印时间过长或过短，伟德体育在线还在凝胶中或穿透转印膜
|
先电泳，根据伟德体育在线大小及转印装置选择合适的转印时间
|
|
湿转过程中环境温度过高
|
使用预冷的转膜缓冲液或将装置至于4度
|
|
显色或曝光后无条带
|
胶与膜方向反了
|
转膜时应依次放好PDVF膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,PDVF膜对应正极。
|
|
选用的一抗、二抗及显色方法不合适
|
选择合适的一抗、二抗和显色方法
|
|
目的伟德体育在线含量低于检测下限
|
加大上样量或浓缩样品
|
|
抗体效价过低
|
增加抗体浓度
|
|
抗体孵育时间不足
|
延长孵育时间，37°C孵育1小时以上
|
|
抗体过度洗涤
|
减少洗涤时间及次数
|
|
加入HRP底物反应与曝光检测之间间隔时间过长
|
反应3到5分钟及时检测
|
|
背景过高
|
封闭物用量不足
|
提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜
|
|
封闭物使用不当
|
检测生物素标记的伟德体育在线时不可用脱脂奶粉封闭
|
|
封闭时间不够
|
室温37度封闭1小时以上，4度封闭过夜
|
|
抗体非特异性结合
|
降低抗体浓度，减少孵育时间
|
|
抗体浓度过高或洗涤不够
|
降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间
|
|
化学显色底物过多
|
按说明书加入适量的显色底物
|
|
杂带多
|
杂伟德体育在线多
|
处理目的伟德体育在线
|
|
抗体特异性不强
|
使用特异性强的抗体
|
|
抗体孵育时间过久
|
减少抗体孵育时间
|
|
二抗与抗原有交叉反应
|
选择合适的封闭物
|
|
底物显色与曝光时间长了
|
缩短显色及曝光的时间
|
|
大分子量WB
|
膜孔径太小
|
更换孔径较大的膜
|
|
转膜电压电流低
|
提高电压/电流
|
|
转膜时间短
|
延长转膜时间
|
|
胶浓度太大
|
使用低浓度的胶
|
|
转膜缓冲液配方不合适
|
调整转膜缓冲液中甲醇及SDS浓度
|
